鬼筆環(huán)肽是從一種劇毒磨菇中分離出來的一種多肽物質(zhì),屬于毒傘肽類毒素,是一種強(qiáng)烈毒素。C35H48N8O11S。無色,細(xì)針狀結(jié)晶。分子量788.87g/mol, 熔點(diǎn)281oC.
1、工作液準(zhǔn)備:
本品以溶于甲醇的20μM儲(chǔ)存液形式提供,總量為300μl。按照100nM的工作液濃度來?yè)Q算,可制備總量為60ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后,根據(jù)單次使用量,對(duì)母液進(jìn)行小量分裝,-20℃避光凍存,一年穩(wěn)定。開始實(shí)驗(yàn)前,使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為:80~200nM?,F(xiàn)配現(xiàn)用。
2、染色步驟:
a、細(xì)胞爬片生長(zhǎng)24h,使其密度達(dá)到50%匯合度。
b、吸掉培養(yǎng)液,37℃預(yù)熱的1×PBS(pH7.4)清洗細(xì)胞2次。
c、使用溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定10min。
d、室溫條件下,用PBS清洗細(xì)胞2~3次,每次10min。
e、室溫條件下,用丙酮(≤-20℃)脫水或者用0.5%TritonX-100溶液透化處理5min。
f、室溫條件下,用PBS清洗細(xì)胞2~3次,每次10min。
g、取200μl配制好的FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液,覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞,室溫避光孵育30min(通常情況下,4℃~37℃孵育皆可)。
h、用PBS清洗蓋玻片3次,每次5min。
i、使用200μlDAPI溶液(濃度:100nM)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染,約30s。
j、用PBS清洗蓋玻片,然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑,然后用指甲油封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存,通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。
k、熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察,選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片(Ex/Em=496/516nm)和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片(Ex/Em=364/454nm)。