自PCR技術(shù)誕生以來已經(jīng)有三十年了,從經(jīng)典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR,這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。很多人的實驗根本離不開PCR。筆者曾經(jīng)也接觸PCR很長一段時間,加樣、設(shè)置程序、等待、檢測。這些過程看起來容易,但實驗結(jié)果卻總是會出人意料,很多時候根本不知道是哪里出了錯。那么要是有一款技術(shù),它比PCR更快速、便捷、,你會感興趣嗎?
RPA是什么?
基本原理
重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶:能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性,*反應(yīng)溫度在37°C左右。
重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成,對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合,防止進(jìn)一步替換。在這個體系中,由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進(jìn)行得非常快,一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。
圖片來源:Isothermal amplified detection of DNA and RNA
引物設(shè)計
RPA分析的關(guān)鍵在于擴增引物和探針的設(shè)計。PCR引物多半是不適用的,因為RPA引物比一般PCR引物長,通常需要達(dá)到30-38個堿基。引物過短會降低重組率,影響擴增速度和檢測靈敏度。在設(shè)計RPA引物時,變性溫度不再是影響擴增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設(shè)計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟,用戶需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。
優(yōu)勢
常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟,而PCR儀本質(zhì)上就是一個控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的zui適溫度在37℃-42℃之間,無需變性,在常溫下即可進(jìn)行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要溫控設(shè)備,RPA可以真正實現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。
據(jù)介紹,RPA檢測的靈敏度很高,能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA)模板擴增到可以檢出的水平,從單個模板分子得到大約1012擴增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理,適用于無法提取核酸的實地檢測。
RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA,還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產(chǎn)物進(jìn)行終點檢測,還可以對擴增過程進(jìn)行實時監(jiān)控,甚至可以通過試紙條(側(cè)流層析試紙條LFD)讀取結(jié)果。
RPA可以用來干什么?
RPA對硬件設(shè)備的要求很低,特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。以下為大家介紹RPA在細(xì)菌、病毒檢測以及癌癥研究等領(lǐng)域的應(yīng)用情況。
RPA成為致病菌檢測的得力工具
在今年發(fā)表的一系列文章中,RPA技術(shù)被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結(jié)核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙門氏菌、大腸埃希菌STEC等常見致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面,為人們提供了簡單快速的實地篩查方案。(這篇文獻(xiàn)之前報道過,在這里就不詳述了。)[詳細(xì)]
RPA技術(shù)建立沙眼衣原體快速檢測方法
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)感染是zui常見的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口,常見于小于25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ),這種方法只適合于經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的人員在具有特定儀器的實驗室使用。
日前,發(fā)表在《分子診斷雜志》(The Journal of Molecular Diagnostics)雜志上的一項研究中,研究人員利用RPA技術(shù)開發(fā)了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法,利用該方法在20分鐘內(nèi)即可得出檢測結(jié)果。[參考文獻(xiàn)]
研究人員利用RPA技術(shù)直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體,不需要從尿液樣品提取總DNA,也不需要專門的儀器設(shè)備。而且該檢測方法還具有少費力、少耗時、更經(jīng)濟(jì)等特點。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言,該方法還能夠顯著提高檢測的敏感性和特異性
RPA檢測瘧原蟲
澳大利亞科學(xué)家捕捉到瘧原蟲入侵并摧毀人體紅細(xì)胞畫面
核酸擴增是目前zui靈敏的瘧原蟲(P. falciparum)特異性檢測法。然而,PCR需要熱循環(huán)設(shè)備和專業(yè)性操作,資源匱乏的地區(qū)往往難以滿足這些條件。在這種情況下,與側(cè)流層析結(jié)合的RPA有著很大的應(yīng)用前景。
《Malaria Journal》雜志今年三月份發(fā)表的一項研究中,研究人員將RPA基礎(chǔ)反應(yīng)、TwistAmp nfo探針和側(cè)流層析結(jié)合起來,實現(xiàn)了瘧原蟲18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下,只需要不到十分鐘的擴增,就能檢出含有四個瘧原蟲的樣本。加上側(cè)流層析的檢測時間,整個流程總共只需要15分鐘,而且肉眼可以直接看到檢測結(jié)果。
研究人員用不同瘧原蟲測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示,所有瘧原蟲都被成功檢出,所有非瘧原蟲都得出了陰性結(jié)果。文章指出,這一方案將大大改善資源匱乏地區(qū)的瘧原蟲分子診斷。[參考文獻(xiàn)]
RPA檢測冠狀病毒
2012年在中東鑒定的中東呼吸綜合癥冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲,給公共安全機構(gòu)敲響了警鐘。
目前,MERS-CoV檢測主要依賴于實時RT-PCR,需要收集患者樣本然后到專門的實驗室去檢驗。因此,亟需能夠進(jìn)行實地檢測的快速裝置。
《PLOS Currents:Outbreaks》去年十二月發(fā)表的一項研究,開發(fā)了一個能在3-7分鐘內(nèi)鑒定MERS-CoV的便攜式RT-RPA裝置。在42°C條件下,等溫MERS-CoV RT-RPA與實時RT-PCR一樣敏感,可檢出10個RNA分子。文章指出,這個便攜裝置是監(jiān)控MERS-CoV傳播,尋找其動物宿主的理想方法。[參考文獻(xiàn)]
RPA檢測埃博拉等十種致命威脅
檢測傳染性疾病的綜合panel,有助于資源匱乏地區(qū)進(jìn)行實地分子診斷,對生物防御工作也有很大的幫助。
《Journal of Clinical Microbiology》雜志去年四月的一項研究開發(fā)了一個RPA檢測panel,對土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、天花病毒進(jìn)行RPA分析,對裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus)、埃博拉病毒、Sudan病毒和馬爾堡病毒進(jìn)行RT-RPA分析。研究顯示,這些RPA和RT-RPA的分析靈敏度大多在16-21個分子之間(與實時PCR相當(dāng)),42°C下只需運行6-10分鐘,而且不存在交叉反應(yīng)。[參考文獻(xiàn)]
RPA檢測HIV
在HIV診治中,即時檢測是非常重要的,對嬰兒來說更是如此。有案例顯示,HIV感染后立刻進(jìn)行治療就能控制住患者體內(nèi)的病毒,讓它們無法進(jìn)行復(fù)制。舉例來說,生來就攜帶HIV的密西西比嬰兒,在出生后立即得到了治療。后來這個孩子停藥了兩年多,病毒復(fù)制依然得到了控制。
目前嬰兒HIV診斷的金標(biāo)方法是DNA PCR,但許多地區(qū)并不具備這樣的條件。在這種條件下,RPA技術(shù)正好可以大展身手。(四篇論文介紹了RPA在HIV檢測中的應(yīng)用)[詳細(xì)]
RPA在癌癥研究中的應(yīng)用
去年六月,新加坡A*STAR的研究團(tuán)隊在Lab on a Chip雜志上,發(fā)表了一種能夠快速檢測癌癥單點突變的新技術(shù),等溫固相擴增/檢測(ISAD)。這是一種無需標(biāo)記的實時檢測技術(shù),將基于硅基微環(huán)(silicon microring)的固相擴增與等溫重組酶聚合酶擴增(RPA)結(jié)合在一起。
去年十月,Talanta雜志上也發(fā)表了一項用到RPA技術(shù)的癌癥研究。該研究在超靈敏生物條碼分析(BBC)、適配體(aptamer)和RPA的基礎(chǔ)上,開發(fā)了一個檢測細(xì)胞色素C(Cyto-c)的新生物條碼分析法(ABC)。細(xì)胞色素C是細(xì)胞死亡的重要標(biāo)志物。(點擊鏈接查看這兩項研究的詳細(xì)報道和文獻(xiàn))[詳細(xì)]
RPA全攻略之疑難解答
說了這么多,你們肯定會有很多疑問,引物怎么設(shè)計?RPA反應(yīng)能實現(xiàn)多重化么?RPA反應(yīng)能對模板進(jìn)行定量么? RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么? RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么?以下就為大家一一解答。
RPA的擴增引物可以說是整個反應(yīng)的關(guān)鍵所在,那么怎樣才能設(shè)計好RPA引物呢?引物長度怎樣選擇?引物序列有什么要求?擴增產(chǎn)物長度有何限制?篩選的主要流程?答案詳見《RPA:引物與探針的常見問題》一文。此外,在該文中你還可以找到以下問題的答案。
可以。RPA在同一個管中同時進(jìn)行多個擴增反應(yīng)。不過,多重化的引物組合需要精心設(shè)計,以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是,RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)不要超標(biāo)太多。如果在一個反應(yīng)中使用兩個以上的擴增引物,就應(yīng)該控制不同引物的量。另外,我們應(yīng)當(dāng)事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設(shè)備以及熒光團(tuán)的兼容性。
可以。擴增子達(dá)到可檢出水平的時間,依賴于反應(yīng)起始時的模板量。初始模板的拷貝越多,擴增子就越快達(dá)到可檢出水平。不過,這種定量需要精心的實驗安排,確保對照反應(yīng)是同時開始的。舉例來說,可以利用鎂離子的添加時間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系,RPA反應(yīng)就會開始。
此外,較慢的擴增過程有助于更的定量。我們可以通過調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計來減慢RPA的反應(yīng)速度。
可以。這樣比較的是反應(yīng)開始時的熒光和反應(yīng)結(jié)束時的熒光,熒光增強意味著發(fā)生了擴增。
支持。在RPA反應(yīng)中,連有生物素或熒光團(tuán)的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據(jù)悉還沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。
可以。插入性染料可以在RPA反應(yīng)中進(jìn)行定量和監(jiān)控。不過,這種染料可以結(jié)合任何雙鏈DNA,會生成來自引物的假陽性信號。由于RPA擴增在常溫下進(jìn)行,這種噪音會比PCR嚴(yán)重一些。
需要。RPA反應(yīng)中的物質(zhì)會干擾瓊脂糖電泳,如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收,跑出來的帶會出現(xiàn)拖尾。
信息來源:http://www.biodiscover。。com/topic/technology/310.html