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  • 標記二抗的選擇及應用實例
  • 點擊次數(shù):2439 更新時間:2016-01-24
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  •    標記二抗的作用

      二抗是在其它宿主體內制備的能與一抗或一抗片段結合的抗體,上面通常連有酶或熒光素等標簽。由于標記二抗所具備的優(yōu)點使得其在免疫學實驗中得以應用廣泛,如western blot(通過與特異性抗體結合來鑒定蛋白質),ELISA,免疫組織化學(檢測組織中的特異性抗原),免疫細胞化學(通過免疫學方法檢測細胞的抗原組成),流式細胞術及免疫沉淀(通過抗原與抗體的特異性結合作用來分離相應抗原)。

      二抗針對某一特定物種(如小鼠)的所有抗體均具有特異性,因而使用標記二抗可以免去對每一個一抗進行標記,大大節(jié)省了時間和費用;此外,一個一抗分子可以同時結合幾個二抗分子,從而使信號大大增強,提高了實驗靈敏度。

      標記二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標記,可以是酶,熒光素,或生物素。

      標記二抗的選擇

      通常情況下,某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇,如何能選擇到該實驗的二抗,需要綜合以下幾個方面進行考慮:

      一抗的物種來源

      一抗是在什么物種來源的,相應的二抗也要是抗該物種的抗體。例如,如果一抗是在小鼠體內制備的,那么你就應當選擇抗小鼠的二抗,如果一抗是在兔體內制備的,那么二抗就應當是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動物中制備的對二抗的質量并無明顯的影響。

      一抗是屬于哪個類或亞類

      二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,因此相應的標記二抗就是抗IgG抗體。單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品列表中列出,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgM,或是抗小鼠IgG抗體。

      如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合,或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么二抗在雙標記實驗中尤其適合。

      如果你不知道一抗是哪一類別或亞類,那么抗小鼠IgG是一個不錯的選擇,因為此種抗體可以識別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。

      標記二抗應用實例分析

      為分析標記二抗的使用情況,我們隨機抽取了100篇2007年或2008年發(fā)表于Science 或 Journal of Biological Chemistry雜志上的 文章(英文),這些文章涵蓋了來自于16個國家的約80個研究機構。收集的數(shù)據(jù)顯示二抗的使用非常廣泛,可以應用到幾乎所有類型的免疫檢測中,尤其是Western blot、免疫組織化學和免疫細胞化學。事實上,二抗在ELISA及流式細胞術中應用也很廣泛,不僅用于科學研究,而且廣泛的應用于臨床分析和疾病診斷。比較而言,二抗在免疫沉淀中的應用相對較少。以下內容是基于對所收集的二抗信息進行統(tǒng)計分析后得出的一些結論,對于您在具體的實驗中如何選擇的抗體具有借鑒作用。

      選擇二抗時,您必須考慮到以下因素,如一抗的物種、產(chǎn)生二抗的宿主、一抗的類別或亞類、二抗所耦聯(lián)的探針類型及二抗的形式(如整個IgG分子,F(xiàn) (ab’) 2片段,或Fab片段)等等。因此選擇哪種類型的二抗很大程度上決定于您所使用的一抗是什么,尤其針對種屬和類別而言。通常情況下,一抗可以在山羊、小鼠、兔子、大鼠及綿羊體內制備,其中屬小鼠及兔子zui為常見,相應的,標記二抗的種屬也應當與一抗的相一致。而對于制備二抗的宿主,則應選擇另外一種不同的動物,一般選用驢、山羊、兔子、綿羊或其他較大的動物,可以實現(xiàn)二抗的大規(guī)模制備,其中又屬山羊使用zui多。

      對于二抗類別或亞類的選擇,應遵循與一抗類別或亞類相一致的原則,其中抗IgG使用zui多。這可能是因為除了五種類別的單克隆抗體外,很多一抗是多克隆抗體,屬于IgG類免疫球蛋白。此外anti-IgG可以識別幾乎所有類型的IgG亞類,因此,在不清楚一抗是屬于那個類別或亞類的時候,anti-IgG抗體是個不錯的選擇。從我們的數(shù)據(jù)來看,值得注意的是, IgG亞類特異性的二抗(如抗IgG1,抗IgG2,抗IgG2a,抗IgG2b)通常用于雙標記實驗中,包括免疫細胞化學、免疫組織化學及流式細胞術。

      此外,整個IgG分子是zui常用的一種二抗分子形式,而F (ab’) 2片段或Fab片段一般僅用于特殊實驗中,如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況,或需要封閉內源性免疫球蛋白的時候。

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