細(xì)胞膜熒光探針是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△4 m的理想熒光探針??梢詸z測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時,細(xì)胞膜熒光探針聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成聚合物,可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時,細(xì)胞膜熒光探針不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時細(xì)胞膜熒光探針為單體,可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。
線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過細(xì)胞膜熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降,同時也可以用細(xì)胞膜熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。單體的Zui大激發(fā)波長為 515nm,Zui大發(fā)射波長為529nm;聚合物的Zui大激發(fā)波長為585nm,Zui大發(fā)射波長為590nm 。實(shí)際觀察時,使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。
染色步驟:
1、于6-,12或24-孔板上進(jìn)行細(xì)胞鋪板,密度為5×105 cells/mL。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。選擇合適的化合物根據(jù)特定的步驟進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)。 注:進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)時的細(xì)胞密度建議不超過1×106 cells/mL,也可根據(jù)自己的細(xì)胞類型培養(yǎng)至合適的密度。
2、取0.5 mL細(xì)胞懸液至無菌的離心管內(nèi)。
3、室溫條件400 x g離心5 min;吸掉上清。
4、用0.5 mL
細(xì)胞膜熒光探針工作液重懸細(xì)胞,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育15-30 min;注意:一般情況,15 min足以進(jìn)行充分的染色。
5、室溫條件400 x g離心5 min;吸掉上清。
6、用2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞,之后室溫條件400 x g離心5 min;吸掉上清。
7、重復(fù)步驟6。
8、用0.5 mL新鮮培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞,即可進(jìn)行后續(xù)的流式分析。
注意事項:
1、如果一次使用量較小,需把每管再適當(dāng)進(jìn)行分裝,盡量避免反復(fù)凍融。
2、為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。