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技術文章首頁 > 技術文章 熒光探針都有那些你不知道的化學性質(zhì)
  • 熒光探針都有那些你不知道的化學性質(zhì)
  • 點擊次數(shù):1686 更新時間:2018-12-21
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  •   熒光探針是在紫外-可見-近紅外區(qū)有特征熒光,并且其 熒光性質(zhì)可隨所處環(huán)境的性質(zhì),如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的一類熒光性分子。
     
      常用于熒光免疫法中標記抗原或抗體,亦可用于微環(huán)境,如表面活性劑膠束、雙分子膜、蛋白質(zhì)活性位點等處微觀特性的探測。通常要求探針的摩爾吸光系數(shù)大,熒光量子產(chǎn)率高;熒光發(fā)射波長處于長波且有較大的斯托克斯位移;用于免疫分析時,與抗原或抗體的結合不應影響它們的活性。
     
      熒光探針的化學性質(zhì):熒光定量PCR所使用的熒光化學制劑可分為兩種:熒光探針和熒光染料。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
     
      實時熒光PCR技術靶基因的確定及引物和探針的設計原則
     
      1.靶基因的確定:選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性。
     
      2.檢測片段的確定:選擇檢測組內(nèi)的保守 、組間特異的序列作為引物探針的設計位置。片段長度70-150bp。
     
      3.引物:長度17-25bp;GC含量30-80%;退火溫度(Tm值)58-60℃;避免穩(wěn)定的引物二聚體及發(fā)夾結構;序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G,3’端避免G或C,后5個堿基內(nèi)避免兩個以上的G或C。
     
      4.熒光探針:長度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值為68-70℃;避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結構;5’端不能是G;位置盡量靠近上游引物;選擇波長差異較大或Fam的熒光標記。
     
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