轉(zhuǎn)染試劑是一種試劑 轉(zhuǎn)染試劑是一種適合于把質(zhì)?;蚱渌问降暮怂?以及核酸蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。
轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)點(diǎn)
1、轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)單。
2、無(wú)明顯細(xì)胞毒性,用 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,大多數(shù)細(xì)胞72小時(shí)內(nèi)不更換培養(yǎng)液無(wú)明顯細(xì)胞毒性。
3、 轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞都適用,并且可以用于穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。
使用說(shuō)明
1. 細(xì)胞培養(yǎng):以293T細(xì)胞為例,轉(zhuǎn)染前一天(20-24小時(shí)) ~0.4×106 細(xì)胞(具體的細(xì)胞數(shù)量據(jù)細(xì)胞大小和細(xì)胞生長(zhǎng)速度而定)鋪到六孔板內(nèi),使第二天細(xì)胞匯合度(confluent)能達(dá)到約50%~70%。
2. 在進(jìn)行下述轉(zhuǎn)染步驟前,把六孔板每孔內(nèi)換成新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的體積約為2 ml。
注:其他培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)液體積參見(jiàn)《各種培養(yǎng)介質(zhì)下 轉(zhuǎn)染DNA詳表》,抗生素、Glutamine等對(duì) 轉(zhuǎn)染并無(wú)影響。如果LipoFiter對(duì)目的細(xì)胞毒性較大,轉(zhuǎn)染試劑建議去除轉(zhuǎn)染體系內(nèi)的抗生素。
3. 把 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻。
4.對(duì)于待轉(zhuǎn)染的六孔板中一個(gè)孔的細(xì)胞,取一只潔凈無(wú)菌離心管,加入4 mg質(zhì)粒DNA(其他培養(yǎng)介質(zhì)DNA用量參見(jiàn)附表)到250 ml DMEM溶液,用槍輕輕吹打混勻。
5. 取另一只潔凈無(wú)菌離心管,加入250 ml DMEM溶液,再加入10 ml (其他培養(yǎng)介質(zhì) 用量參見(jiàn)附表),用槍輕輕吹打混勻,室溫放置5分鐘。
6. 將步驟4與5中的DNA溶液與 溶液混合,用槍輕輕吹打混勻。注意:不可Vortex或離心。
7. 室溫孵育20分鐘。有可能出現(xiàn)絮狀沉淀物,屬正?,F(xiàn)象,不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。
8. 轉(zhuǎn)染試劑無(wú)論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞,均把500 ml -DNA混合物全部加入六孔板的一個(gè)孔內(nèi)。加入時(shí)注意盡量均勻加入到整個(gè)孔內(nèi),隨后輕輕“8”字搖擺混勻。
注:針對(duì)貼壁細(xì)胞,如上述所說(shuō),只需將 -DNA復(fù)合物加入細(xì)胞中孵育6小時(shí)再換液即可。若是轉(zhuǎn)染懸浮或半懸浮細(xì)胞,則推薦通過(guò)平角離心轉(zhuǎn)染法,即將適量的 -DNA復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后(步驟8),封口膜封好,放入平角離心機(jī),低速(200 g)離心1.5 小時(shí),然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6小時(shí)再換液即可。
9. 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-12小時(shí)后,去除含有 -DNA的無(wú)血清培養(yǎng)液。每孔加入2 ml新鮮含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
注:通常 -DNA混合物和細(xì)胞一起孵育6小時(shí)已經(jīng)足夠產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染試劑大多數(shù)細(xì)胞和 -DNA一起培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)未見(jiàn)明顯細(xì)胞毒性。但轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液對(duì)于一些生長(zhǎng)非??焖俚募?xì)胞有助于提高轉(zhuǎn)染效率。對(duì)一些比較易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如HEK-293T細(xì)胞,換液可視細(xì)胞生長(zhǎng)狀況而定,無(wú)需為提高轉(zhuǎn)染效率而換液。
10. 轉(zhuǎn)染后續(xù)處理:
1) 對(duì)于基因表達(dá),再培養(yǎng)24-40小時(shí)后即可檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果,如轉(zhuǎn)染帶GFP或者其他熒光基因的表達(dá)載體,可用熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
2) 轉(zhuǎn)染試劑用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,則在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)即可加入適當(dāng)?shù)暮Y選藥物,例如G418或Puromycin(嘌呤霉素)等,進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。